对于 Delphi 10.1和更新版本，有一个属性TrailingLineBreak控制此行为。
当TrailingLineBreak属性为True（默认值）时，Text属性将在最后一行后包含换行符。如果为False，则Text值在最后一行后不包含换行符。这也可以由soTrailingLineBreak选项控制。

对于 Delphi 10.1（柏林）或更新版本，最佳解决方案在Uwe的回答中描述。
对于较旧的 Delphi 版本，我通过创建TStringList的子类并重写TStrings.GetTextStr虚函数找到了解决方案，但我很高兴知道是否有更好的解决方案，或者其他人是否在我的解决方案中发现了错误

接口：

uses
    Classes;

  type
    TMyStringList = class(TStringList)
    private
      FIncludeLastLineBreakInText : Boolean;
    protected
      function GetTextStr: string; override;
    public
      constructor Create(AIncludeLastLineBreakInText : Boolean = False); overload;
      property IncludeLastLineBreakInText : Boolean read FIncludeLastLineBreakInText write FIncludeLastLineBreakInText;
    end;

实现方式：

uses
  StrUtils;      

constructor TMyStringList.Create(AIncludeLastLineBreakInText : Boolean = False);
begin
  inherited Create;

  FIncludeLastLineBreakInText := AIncludeLastLineBreakInText;
end;

function TMyStringList.GetTextStr: string;
begin
  Result := inherited;

  if(not IncludeLastLineBreakInText) and EndsStr(LineBreak, Result)
  then SetLength(Result, Length(Result) - Length(LineBreak));
end;

示例：

procedure TForm1.Button1Click(Sender: TObject);
var
  Lines : TStrings;
begin
  Lines := TMyStringList.Create();
  try
    Lines.LoadFromFile('.\input.txt');
    Lines.SaveToFile('.\output.txt');
  finally
    Lines.Free;
  end;
end;

怎么样：

Lines.Text:=Trim(Lines.Text);